Pasteur-pipetin toimintaperiaate perustuu ensisijaisesti painovoiman{0}}ohjaamaan virtaukseen ja kapillaaritoimintaan yhdistettynä ilmanpaine-erojen manuaaliseen ohjaukseen nesteiden imemisen ja siirron helpottamiseksi.
Manuaalinen imuohjaus: Käyttäjä imee pipetin leveää päätä -joko suullisesti tai käyttämällä ylimääräistä kumipalloa- luodakseen alipaineen putkeen ja vetäen näin nestettä hienoon kärkeen.
Painovoima-ohjattu annostelu: Kun imu on vapautettu, neste virtaa ulos luonnollisesti painovoiman vaikutuksesta. annostelua voidaan auttaa myös puristamalla kevyesti pipetin runkoa tai kallistamalla vastaanottoastiaa.
Pisaroiden toistettavuus: Kalibroimalla "pisaroiden millilitraa kohti" suhde pipetti mahdollistaa likimääräisen kvantitatiivisen siirron, mikä tekee siitä sopivan toimenpiteisiin, jotka vaativat toistettavuutta absoluuttisen tarkkuuden sijaan.
Steriiliyden vakuutus: Ennen käyttöä pumpulitulppa voidaan työntää leveään päähän ja steriloida mikrobikontaminaation estämiseksi käsittelyn aikana-, mikä on erityisen yleinen mikrobiologisissa kokeissa.